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本试剂盒采用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling)方法，灵敏度高、特异性强、使用方便快捷。对于经过固定和洗涤的组织样本(石蜡切片、冰冻切片)和细胞样本(贴壁细胞、悬浮细胞)，只需经过一步染色，洗涤后便可以进行凋亡检测。本试剂盒还提供了DNase I阳性对照和Proteinase K，以便操作。

末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂DNA的3′-羟基(3′-OH)末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP)。FITC-12-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量检测。


细胞凋亡(Apoptosis)的一个显著特点是细胞染色体DNA的降解，在一些内源性核酸内切酶的作用下，核小体间的DNA被切断，从而产生不同长度的寡聚核小体片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的180～200bp DNA Ladder图谱，而坏死细胞的DNA呈弥漫的连续图谱。


对照实验：采用某国内知名品牌TUNEL检测试剂盒作为对照，在相同的实验条件下，用Apoptosis Activator 2处理C6细胞，荧光显微镜观察细胞凋亡后的荧光染色情况。
检测结果：如图1所示，我司一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒灵敏度明显更高，染色效果更好。

图1．使用我司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒与其他品牌检测效果的比较

组分	20T	50T
TdT Dilution Buffer (选用)	500μL	1.25mL
TdT Enzyme (10×)	100μL	250μL
FITC-12-dUTP Labeling Mix	900μL	1.13mL×2
Proteinase K (2mg/ml)	40μL	100μL
DNase I(0.5mg/ml)	5μL	13μL
10×DNase I Buffer	100μL	250μL
说明书	1份	1份

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• 配制TUNEL检测液之后的步骤注意避光操作。
  
• 若配制TUNEL检测液操作时间较长，请将TdT Enzyme (10×)、FITC-12-dUTP Labeling Mix和配好的检测液置于冰上暂时保存。
  
• 需自备PBS或HBSS，抗荧光衰减封片剂(货号：LA10322或LA10323)，组织固定液(货号：LA10973)或4%多聚甲醛，Triton X-100，二甲苯，无水乙醇等。
  
• PBS或HBSS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS或HBSS溶液后再进行下一步反应。
  
• 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
  
• 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。

• 样本预处理
  
  • 石蜡包埋组织切片
    
    • 脱蜡：室温下将石蜡切片放入二甲苯中浸泡5～10分钟，更换新鲜的二甲苯再浸泡5～10分钟，以彻底脱掉石蜡。
      
    • 水化：在无水乙醇中浸泡5分钟，更换新鲜的无水乙醇再浸泡5分钟。在梯度乙醇(90、80、70%)中各浸洗1次，每次3分钟，逐渐增加水分。
      
    • 洗涤：用PBS或HBSS轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，以便后续操作。在实验过程中，切勿使样品干燥，处理好的样本应放于湿盒中保持湿润。
      
    • 通透：用PBS按照1:100的比例稀释Proteinase K (2mg/ml)，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加100μL的Proteinase K (20μg/ml)，使溶液覆盖全部样本区域，20～37℃孵育15～30分钟。
      注：Proteinase K有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化Proteinase K孵育的温度和时间。
      
    • 洗涤：用PBS或HBSS润洗样本2～3次，轻轻吸干多余液体，处理好的样本放在湿盒中保持湿润。
      注：Proteinase K需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。
  • 组织冰冻切片
    
    • 固定：取出冰冻切片，并回温至室温。在组织固定液或4%多聚甲醛(配制于新鲜的PBS)中浸泡，室温下固定30分钟。
      
    • 洗涤：轻轻吸干多余液体，并将切片浸没在PBS或HBSS中，室温孵育10～15分钟。按此步骤重复洗涤一次，然后轻轻吸干多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，以便后续操作。在实验过程中，切勿使样品干燥，处理好的样本应放于湿盒中保持湿润。
      
    • 通透：用PBS按照1:100的比例稀释Proteinase K (2mg/ml)，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加100μL的Proteinase K (20μg/ml)，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10分钟。(也可浸于含0.5% Triton X-100的PBS中，室温孵育5分钟进行通透处理。)
      注：Proteinase K有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化Proteinase K孵育的温度和时间。
      
    • 洗涤：在PBS或HBSS中浸没洗涤样本2～3次，并用滤纸轻轻吸干多余液体。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。
      注：Proteinase K需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。
  • 贴壁细胞或细胞涂片
    
    • 洗涤：取出制备好的细胞爬片、涂片或是细胞贴壁良好的培养板，用PBS或HBSS洗涤一次。
      
    • 固定：加入组织固定液(货号：LA10973)或4%多聚甲醛(配制于新鲜的PBS)，室温下固定30分钟。
      
    • 洗涤：用PBS或HBSS洗涤一次。
      
    • 通透：用PBS按照1:100的比例稀释Proteinase K (2mg/ml)，使其终浓度为20μg/ml。在样本上滴加适量Proteinase K (20μg/ml)，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育5分钟。(也可使用含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟进行通透处理。)
      注：Proteinase K有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化Proteinase K孵育的温度和时间。
      
    • 洗涤：用PBS或HBSS洗涤2～3次。
      注：Proteinase K需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。
  • 悬浮细胞或细胞悬液
    
    • 洗涤：离心收集细胞(不超过200万细胞)，用PBS或HBSS洗涤一次。
      
    • 固定：加入组织固定液(货号：LA10973)或4%多聚甲醛(配制于新鲜的PBS)，室温下固定30分钟。
      注：为防止细胞聚团，应置于摇床上缓慢摇动进行固定。
      
    • 洗涤：用PBS或HBSS洗涤一次。
      
    • 通透：用PBS按照1:100的比例稀释Proteinase K (2mg/ml)，使其终浓度为20μg/ml。加入适量Proteinase K (20μg/ml)重悬细胞，室温孵育5分钟。(也可使用含0.3% Triton X-100的PBS重悬细胞，室温孵育5分钟进行通透处理。)
      注：Proteinase K有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化Proteinase K孵育的温度和时间。
      
    • 洗涤：用PBS或HBSS洗涤2～3次。
      注：Proteinase K需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。
  
  
  
• DNase I处理阳性对照(可选)
  
  • 用去离子水按1:10的比例稀释10×DNase I Buffer(例如：每个样本需用200μL 1×DNase I Buffer，即用20μL 10×DNase I Buffer和180μL去离子水混合稀释)，取其中100μL滴加到已通透的样本上，室温孵育5min。向剩余100μL 1×DNase I Buffer中加1μlDNase I (0.5mg/ml)，使其终浓度为5μg/ml。
    
  • 轻轻叩掉或吸掉液体，加入100μL含5μg/ml DNase I的缓冲液，室温孵育10min。
    
  • 用PBS或HBSS洗涤3～4次。
    注：DNase I处理固定的细胞会引起染色体DNA的断裂，产生许多可标记的DNA 3’末端，经上述流程处理后通常会引起大多数细胞显现绿色荧光。
  
  
• 配制TUNEL检测液
  计算好样本数量(包括实验组和阳性对照组)，参考表1配制适当量的TUNEL检测液，即用即配，注意避光。对于面积小于5cm2的一个标准反应(如：涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一个孔)，所需体积是50μ l，用50μ l乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TUNEL检测液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积(如6孔板的一个孔TUNEL检测液宜使用100μ l)。
  表1．准备用于实验的和可选阳性对照反应的TUNEL检测液
  

  成分	用量
  TdT Enzyme (10×)	5μL
  FITC-12-dUTP Labeling Mix	45μL

  
  注：阴性对照体系为不含TdT Enzyme的TUNEL检测液，即用ddH2O替代TdT Enzyme (10×)。如果TUNEL反应过强造成荧光背景高，可以用本试剂盒提供的TdT Dilution Buffer稀释TdT Enzyme (10×)，即配制TUNEL检测液时，减少TdT Enzyme (10×)的量，加入相应量的TdT Dilution Buffer。
  
  
• 标记与检测
  
  • 组织切片、贴壁细胞或细胞涂片：
    
    • 在样本上滴加50μL TUNEL检测液(6孔板宜加入100μL)。为了使检测液覆盖均匀且防止蒸发，可以将封口膜剪成适当大小，轻盖在已滴加检测液的样本上，也可以用PAPPen圈出一个区域进行染色。载玻片需置于湿盒内，细胞培养板中多余的孔和多孔板的空隙中加入适量水以保持湿润。
      
    • 37℃避光孵育60分钟。
      
    • PBS或HBSS洗涤2～3次。
      
    • 用抗荧光衰减封片剂封片后，在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450～500nm，发射波长范围为515～565nm(绿色荧光)。
  • 悬浮细胞或细胞悬液
    
    • 用50μL TUNEL检测液重悬细胞。
      
    • 37℃避光孵育60分钟，每隔15分钟用微量移液器轻轻重悬细胞。
      
    • PBS或HBSS洗涤2次。
      
    • 用250-500μ l PBS或HBSS重悬细胞。
      
    • 用流式细胞仪分析细胞或者涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450～500nm，发射波长范围为515～565nm(绿色荧光)。

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